掃描電鏡制樣方法｜5種常用的生物樣品干燥方法

掃描電鏡在觀察生物樣品時，具有以下特點：多角度觀察樣品的表面結構；不需要將樣品切成薄片；景深大、圖像立體感強；放大倍數(shù)從幾十倍到幾十萬倍連續(xù)可調；在觀察形貌的同時可以對微區(qū)的成分進行定量和定性分析。而能否獲得真實、清晰、理想的掃描電鏡觀察結果，樣品的制備過程是關鍵。

生物樣品含水直接觀察，會對掃描電鏡造成以下影響：

1. 樣品蒸發(fā)的水蒸氣遭遇高能電子束，會被電離而放電，引起束流大幅度波動，使圖像模糊，或者根本不能成像;

2. 大多數(shù)含水樣品在高真空中容易發(fā)生形態(tài)損傷，表面皺縮、變形;

3. 樣品揮發(fā)會造成鏡頭、光闌等的污染;

4. 燈絲會被上升水蒸氣氧化而變質。

生物樣品的含水量高，二次電子產(chǎn)率低，導電性差，對熱，電子束敏感，僅有少數(shù)樣品如毛發(fā)、牙齒以及含水量極低的昆蟲等可以直接噴鍍觀察，絕大多數(shù)的生物樣品均要求經(jīng)過干燥處理才能鍍金觀察。

干燥是掃描電鏡生物樣品制備中的關鍵環(huán)節(jié)，如果處理不好，會直接影響到觀察的清晰度與準確度。要想制備出好的掃描電鏡生物樣品，需要在干燥過程中盡可能減少由于水分蒸發(fā)而引起的樣品表面形貌的形變，且必須確保干燥。大多數(shù)動植物容易發(fā)生明顯的塌陷和變形。因此，需要針對不同的生物樣品來選擇合適的干燥方法。

掃描電鏡生物樣品制備常用干燥方法

01 自然干燥法

自然干燥法是指樣品中的水分在大氣中自然蒸發(fā)，或樣品經(jīng)脫水處理后脫水劑自然揮發(fā)而干燥的方法。

對干種子、果殼、某些干花粉、昆蟲標本等來說，自然干燥法是一個簡易實用有效的方法，雖然在自然干燥過程中，樣品體積有所收縮，但卻保留了樣品的基本形態(tài)。適用于外表堅硬的樣品，如外表有殼的昆蟲，木材等。

自然風干——飛納掃描電鏡直接觀察螨蟲

02 烘干干燥法

烘干干燥法是將要研究的樣品用烘干箱烘干，一般溫度控制在 80℃ 以下，烘干程度以含水量在 5% 以下為好。此方法的干燥速度較快，但水分蒸發(fā)時可能造成樣品變形或斷裂。適用于不易變形且耐熱的樣品，比如淀粉粒、孢子粉等。

烘干的花粉噴金后直接可以用二次電子觀察

03 臨界點干燥法

臨界點干燥法是利用物質在臨界狀態(tài)下，液體和氣體的密度相等，氣液界面消失，液體的表面張力系數(shù)為零。臨界點干燥法之所以一直被視為制作生物醫(yī)學掃描樣品較可靠的干燥方法，是因為此法能消除液體表面張力的作用，干燥出的樣品能較大程度地保存其自然形態(tài)。

04 冷凍干燥法

冷凍干燥法是將含水樣品放入低溫環(huán)境中冷凍，或使用溶劑將樣品中的水逐級替換后冷凍，然后抽真空升華。它是利用低溫和真空，使樣品中的水分或溶劑直接升華，以達到干燥樣品的目的。冷凍干燥過程不經(jīng)過液相階段，因而避免了氣相和液相之間表面張力對樣品的損傷。

05 真空干燥法

真空干燥法指的是將經(jīng)脫水（多用梯度脫水）的樣品置于真空容器中進行干燥的方法。真空干燥法選用高熔點的有機溶劑（叔丁醇、乙腈、六甲基二硅胺烷、正丁醇等）作升華介質，既保留了冷凍干燥法的優(yōu)點，又不用對樣品進行冷凍處理，無冷凍損傷，且操作簡單。適用于所有生物樣品，特別是細菌、細胞等微小樣品。